【中国科学报】牡蛎基因组诠释生命的睿智(2)

牡蛎基因组的高杂合性和高重复序列对拼接来说具有很大的挑战性。如果采用大熊猫等的全基因组鸟枪法策略，根本无法完成如此复杂的基因组项目。因为采用这样的方法，就会把高度杂合区域的同源序列当做基因组不同的位置都组装出来，而很多不同位置的高度相似的重复序列被误认为来自同一个位点。为此，项目组开发了基于fosmid pooling的多层次分级组装方法，很好地解决了这个问题。

牡蛎基因组测序使用的是一只在美国经过4代近交的被昵称为“丹尼斯”（Dennis）的牡蛎。首先，项目组把牡蛎基因组DNA打断成40 Kbp（千碱基对）左右的片段，每个片段插入一个fosmid载体并转染进细菌，这样每个菌群就携带牡蛎基因组的40 Kbp左右的一段DNA序列。一共构建了大约15万个这样的菌群，整个文库携带了大约5.8 Gbp（十亿碱基对）的DNA片段，相当于牡蛎基因组大小的十倍左右。如果在整个文库中随机挑选90个菌群，其携带的90个片段来自基因组同一个位点或者彼此是重复序列的几率会非常低，这样就可以解决高杂合和高重复序列对拼接造成的困难。把它们混合在一起测序并通过第一级组装获得DNA拼接序列，这样既降低测序成本，又能保证这90个片段的顺利拼接。随后，项目组一共测序并拼接了1600多个混池，获得了更多的拼接序列。将这些序列再进行第二级组装，获得超级重叠序列群。最后，利用大片段测序文库的信息，对这些组装序列进行定位和排序，最终获得了牡蛎基因组组装序列。有了这个良好的序列组装基础，就可以进一步深入了解牡蛎基因组结构特征，发现平均每43 bp的序列中就存在一个由SNP（单核苷酸多态性）或者InDel（插入—缺失）导致的变异，比大多数已有报道的物种都要高，其变异频率是人类等哺乳动物的10倍以上。此外，牡蛎基因组的重复序列含量也非常高，占到了基因组的36%，一些转座子仍然十分活跃。在此基础上，借助转录组、表达谱以及蛋白组等多组学技术，就可从多层次多视角对牡蛎各种生命活动，包括对逆境适应的分子机制进行精细解读。

众多独特的发育基因浮出水面

项目组利用各分类阶元代表性物种共有的单拷贝基因，建立了分子进化树并估算各个分支之间的分化距离。研究发现两侧对称动物与辐射对称动物大约在6.9亿年前发生分化，而牡蛎与人的共同祖先大约在6.2亿年前开始分化。分化年代的估算结果支持生物物种大爆发是发生在早寒武纪之后一段时间的学术观点。

项目组对牡蛎不同发育时期、不同器官的样品进行了全基因组表达研究。从受精开始，每隔1个小时取样一次，对前24个小时的发育进行高密度发育谱分析。此后，每天取样一次，直到附着变态形成稚贝。一共获得了38个发育时期的基因表达信息。这些数据对解读不同基因的功能及其调控机制提供了重要参考以及庞大的数据基础。

项目组以进化发育生物学中受到广泛关注的HOX基因簇为例，对牡蛎的发育相关基因特点进行了分析。HOX基因是重要的发育基因，生物体的头尾、左右等体制形成主要由这一类基因决定，如果这类基因在人类中变异，会造成多指症等多种疾病。HOX基因簇包含大约10～15个成员，它们在染色体上的物理位置是依次排列的，在人类中以HOX1～HOX13命名其13个基因。由于脊椎动物经历了两次基因组复制，因此在人类中可以找到4条HOX基因簇。而牡蛎和其他无脊椎动物一样，只有一条HOX基因簇。且牡蛎HOX基因的排列顺序被其他基因插入而打断，造成这些HOX基因在发育过程中的表达时序也被打乱。而且牡蛎还缺失HOX基因簇中的Antp基因。这些变化造成了牡蛎什么样的生物学改变, 它的功能又是由哪些基因来补偿？一系列科学问题尚待进一步研究。

逆境求生——小小牡蛎讲述生存哲学

项目组把牡蛎基因组和人、海胆等7个物种的基因组进行比较，发现了8654个牡蛎特异的基因，这些基因可能在牡蛎或者贝类的进化中起到重要作用。有趣的是，通过功能注释发现这些基因的功能多与抗性防御相关。而通过人工检验，进一步对抗性相关基因进行细致研究，发现一些基因家族在牡蛎中的成员数量远远超过其他物种，这些基因的功能涉及到蛋白折叠，氧化和抗氧化，凋亡和免疫反应等。这些功能都是牡蛎抵抗逆境不可或缺的。比如热激蛋白70（HSP70）在生物抵抗高温等各种逆境中发挥着重要作用，研究人员在牡蛎基因组中鉴定出88个HSP 70基因，，数量远远高于人类中的17个和海胆中的39个。

为了进一步调查这些帮助牡蛎抵抗严酷环境的基因是如何工作的，他们进一步设计实验，检测牡蛎对逆境胁迫的反应。通过检测牡蛎在不同温度、盐度、露空和重金属等60多个逆境条件下的基因表达情况，发现5800多个基因在至少一种应激下发生明显的表达变化，很多调控基因会在不同的逆境条件下被“征用”。同时还发现逆境条件下起作用的基因往往倾向于在基因组中存在其他拷贝，这意味着防御相关基因会复制自己从而随着进化不断增多，这可能对牡蛎适应复杂多变的潮间带生活意义重大。

牡蛎在潮间带生活，每天都要经历两次潮涨潮落，规律性地处在露空环境下。研究发现，牡蛎的凋亡抑制蛋白（IAP）基因数目不仅高度扩张，而且在长时间的露空后， 5个凋亡抑制蛋白的表达量上调了67倍，其他凋亡抑制因子也有相应的上调。除露空之外，这些凋亡抑制因子在高温和低盐条件下也有上调。这些现象充分表明牡蛎中存在着一个强有力的凋亡抑制基因网络，让牡蛎能够耐受露空等逆境胁迫。在露空条件下，牡蛎还会同时受到夏季高温或冬季冰冻带来的温度胁迫，项目组发现，牡蛎也进化出了精密的调控系统来应对这些挑战。牡蛎在受热刺激后，有5个HSP70家族的基因表达量上调了2000倍，约为该样本所有转录本数量总和的4.2%。这些基因和凋亡抑制因子一样，在牡蛎中既存在复制扩张又能够在受到温度刺激后大量上调，从而使其能够生活在温度可以高达近50℃、低温逾-20℃的潮间带环境。

天然的物理屏障——贝壳形成的复杂性